被廣泛使用的傳統ChIP-seq與新技術CUT&RUN和CUT&Tag，如何決定哪種染色質分析法更適合您的實驗呢？在這里，我們將根據EpiCypher的經驗幫您確定最佳檢測方法。

關鍵點1：為何要告別ChIP-seq？

● 樣本要上百萬個細胞——不適用于珍貴細胞類型或臨床樣本

● 繁瑣的操作步驟——需要交聯、染色質片段化和免疫沉淀(IP)，實驗周期約為一周

● 高測序深度——通常需要每個庫2,000 - 4,000萬個讀段才能在背景上獲得足夠的信號

● 數據結果不精準 ——背景高，實驗重復性差和有非特異性的peak

盡管存在以上短板，ChIP-seq仍然是幾十年來應用最guang泛的DNA-蛋白互作技術。然而，新方法、新技術往往給科學研究帶來天翻地覆的變化，CUTANA™ CUT&RUN和CUT&Tag的出現解決了ChIP-Seq實驗需要大量細胞，且重復性差、低信號、高背景等缺點，為研究DNA-蛋白質相互作用提供了新的有效工具。

Figure 1: ChIP-seq與CUT&RUN和CUT&Tag的比較

與ChIP-seq相比，CUT&Tag和CUT&RUN具有許多優點。這兩種檢測方法都不需要交聯、染色質片段化或免疫沉淀，即可提供低背景、高可靠性的實驗結果。同時CUT&RUN和CUT&Tag的實驗周期更短，所需樣本細胞更少，測序深度更低。

常見問題 

科學方法在不斷發展，在表觀基因組學領域尤其如此，在過去的十年中，表觀基因組學經歷了快速的技術增長和擴張。盡管CUTANA™檢測具有明顯的優勢，但許多研究人員對從ChIP-seq轉換到CUTANA™仍很猶豫。在這里，我們羅列出可能會在ChIP-seq過渡到CUTANA™ CUT&RUN分析時常見的一些問題。

Q：我正在研究一種瞬態相互作用蛋白質，需要通過交聯來穩定染色質上的目標定位。我zui-好的選擇不是ChIP-seq嗎?

A: CUT&RUN可以生成背景干凈的實驗數據，免受高度交聯相關的可變IP效率的干擾。如果需要，CUTANA檢測可與輕到中度交聯條件兼容(Fig. 2)。然而，ChIP-seq所需的高度固定方式不能應用于CUT&RUN(或CUT&Tag)。 

Figure 2: CUT&RUN在樣品處理過程中保留了全基因組富集。熱圖中使用新鮮、冷凍或交聯的K562細胞和新鮮細胞核，顯示轉錄起始位點(TSS)的CUT&RUN H3K4me3信號，紅色表示H3K4me3高富集。

Q：我正試圖將我的結果與已有的ChIP-seq數據進行比較——我需要繼續做ChIP-seq嗎?

A：雖然ChIP-seq和CUT&RUN是不同的操作步驟，但原始測序數據是相似的，并且使用相同的工具進行處理和可視化。在已有的文獻中多次發表過這兩種方法的數據比對。主要的區別是CUT&RUN數據的背景要低得多，所需的細胞和測序讀段也比ChIP-seq少了10倍。

Q：我已經有了一個很好的ChIP-seq操作方案或有效的抗體，是否應該堅持用下去?

A：與CUT&RUN相比，即使是優化后的ChIP-seq，也需要更多的時間、細胞和測序深度。此外，ChIP-seq本身存在低通量、高背景和成本較高的問題，CUTANA™ CUT&RUN wan美的解決了這些問題。與ChIP-seq需要交聯、片段化和IP等條件相比，CUT&RUN對大多數目標蛋白和細胞類型的優化需求更低。

Q：由于抗體在ChIP中效果很好，不想換掉ChIP-seq。

A：抗體性能并不是選擇ChIP-seq的一個很好的理由。ChIP級別抗體并不可靠，尤其是組蛋白PTMs。EpiCypher發現超過70%的組蛋白賴氨酸甲基化和酰基化PTMs抗體顯示明顯的交叉反應性和目標蛋白結合效率低的問題。這包括有較高引用率的H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac和H3K27me3抗體。非組蛋白PTM靶標，如轉錄因子，也面臨著類似的挑戰。

關鍵點2：CUT&RUN——“萬能"染色質分析工具

CUT&RUN是大多數表觀基因組實驗的理想工具。它為細胞樣本、目標蛋白兼容性和測序成本之間提供了很好的平衡。該技術操作非常簡單，可根據具體實驗情況進行優化調整，且隨著EpiCypher開發的CUTANA™ CUT&RUN試劑盒的出現而變得更加容易。

與ChIP-seq相比，CUT&RUN的優點如下：

● 針對不同目標蛋白的高分辨率數據：CUT&RUN與組蛋白PTMs和染色質相關蛋白(包括轉錄因子、 表觀遺傳學的識別、記錄和消除蛋白)兼容，(圖3)。 CUT&RUN還可生成很難使用ChIP-seq進行分析的染色質重塑酶圖譜，這也突出了CUT&RUN的另一個關鍵優勢。

Figure 3: CUTANA™ CUT&RUN分析每次反應僅使用300 - 800萬測序讀段，為不同的目標蛋白生成高分辨率數據。*每個實驗都使用CUTANA™CUT&RUN試劑盒和500,000個K562細胞進行。

● 需要的細胞數量較少：雖然建議使用500,000個以上的細胞，但CUTANA™ CUT&RUN在不改變操作步驟的前提下，可將細胞數量降低至5,000個，從而能夠分析不常見的細胞和較珍貴的樣本。目前，CUT&RUN已被用于分析小鼠和人類原代細胞、患者來源的異種移植（PDX）、流式細胞儀分選細胞、免疫細胞等。

● 操作步驟簡單：CUTANA™ CUT&RUN在3天內即可完成從細胞到文庫的建立。還適用于多道移液器和8聯排管，提高了分析的重復性和通量。

● 測序成本降低：只需要300 - 800萬個測序讀段，高通量測序可以檢測更多樣本。

● 減少實驗中需要優化的步驟：如上所述，CUT&RUN跳過了ChIP-seq中zui-具挑戰性的部分(染色質片段化等)，只需要較少的優化步驟。EpiCypher的CUTANA™CUT&RUN Kit和CUT&RUN Library Prep Kit使這一過程更加簡單。

注：根據EpiCypher的經驗，與CUT&Tag相比，CUT&RUN更容易學習和排除故障，特別是在使用EpiCypher的CUT&RUN檢測試劑盒和Library Prep試劑盒時。

關鍵點3：CUT&Tag——“專業級別"染色質分析工具

CUT&Tag更適合在染色質分析測定方面具有經驗的研究人員。如果您是：

● 剛剛開始接觸表觀基因組分析測定

● 經常使用ChIP-seq，打算開始嘗試CUTANA染色質分析

● 打算嘗試一個新的目標蛋白或使用一個新的細胞類型

● 低豐度目標蛋白，如轉錄因子和其他染色質相關蛋白

在這些情況中，EpiCypher建議使用CUT&RUN，它有一個簡單明了的操作步驟，并可為大多數目標蛋白和細胞類型生成可靠精準的實驗結果。

CUT&Tag比CUT&RUN更具挑戰性

許多研究人員想要用CUTANA CUT&Tag進行染色質分析實驗，因為該方法跳過了傳統的文庫準備步驟，只需要10萬個細胞核即可獲得高質量的測序結果。EpiCypher通過du-家的Direct-to-PCR技術進一步簡化了CUT&Tag過程，只需要一個管就可完成從細胞到PCR文庫擴增。

盡管存在以上優勢，根據EpiCypher的經驗，CUT&Tag對相關實驗操作熟悉度有較高的要求。樣品準備不充分或細胞核太少，ConA bead丟失和抗體特異性或效率較低都會影響CUT&Tag的實驗結果。與CUT&RUN相比，CUT&Tag也會容易出現更高的duplication rates，并可能在開放染色質區域出現背景信號。基于這些原因，我們推薦大多數用戶使用CUT&RUN。

CUT&Tag并不適用于所有目標蛋白

EpiCypher推薦使用CUTANA™ CUT&Tag來研究組蛋白PTMs(圖4)和選擇轉錄因子(即CTCF)在全基因組上的結合或分布位點。不建議將CUT&Tag用于染色質相關蛋白分析，這些蛋白通常與染色質結合較弱，在高鹽CUT&Tag溶液中剝離。這是該方法的一個主要缺點，也是EpiCypher繼續建議大多數用戶使用CUT&RUN的原因之一。

注:在ChIP中，樣品被交聯以穩定染色質上的蛋白質，因此允許使用高鹽緩沖液。雖然CUT&Tag與輕度到中度交聯兼容，但這些條件嚴重降低了收率。相反，EpiCypher建議在CUT&RUN中使用新鮮細胞樣本。

Figure 4: CUTANA™ CUT&Tag是分析組蛋白PTMs的理想工具。

CUT&Tag是低樣本量和特殊應用的理想選擇

盡管上面列出了一些注意事項，但值得注意的是CUT&Tag是專門為少量細胞的染色質分析而設計的，是CUT&RUN的補充技術。

為什么CUTANA™ CUT&Tag是低樣本量應用的理想選擇?

● Tn5 tagmentation消除了傳統的交聯、染色質片段化、IP和文庫準備步驟，減少了操作時間并zui大化靶標回收率。當嘗試用少量或單細胞進行分析時，精簡的處理步驟是至關重要的。在CUT&Tag中，pAG-Tn5準確導向結合區域并進行DNA切割，省去了ChIP-seq中最耗時的步驟。

● EpiCypher獨jia的Direct-to-PCR CUT&Tag技術允許您在一個管中完成從細胞到PCR文庫的擴增。而每次細胞/DNA被洗滌，轉移到新的試管中，或在進行純化時，都會面臨丟失樣本的風險。Direct-to-PCR CUT&Tag只需要一個DNA純化步驟，可以在短短兩天內完成。

● CUTANA CUT&Tag操作中shou選100,000個核，但對于一些選定的目標，可低至1,000個核(圖5)。由于CUTANA CUT&RUN分析驗證過的最少是5,000個細胞，因此CUT&Tag為研究人員突破表觀基因組學的檢測界限提供了解決方法。

Figure 5: CUT&Tag僅使用1000個細胞即可生成低豐度(H3K4me3)和高豐度(H3K27me3)組蛋白PTMs的高質量圖譜。

選擇適合您的染色質分析測定方法 

下面是一個快速檢查表，可以幫助您為您的項目選擇最佳的檢測方法:

（一）推薦使用CUT&RUN作為首xuan的染色質分析檢測方法，適用于多種目標蛋白、細胞類型和細胞處理條件。如果每次反應可以有5,000到500,000個細胞，并且滿足以下條件，CUT&RUN為zui-優選擇：

1．剛開始接觸染色質分析或CUTANA™技術

2．新的目標蛋白或使用新的細胞類型

（二）CUT&Tag是創新型應用于極少量細胞樣本的分析方法。適合于有經驗的研究人員。

1．CUT&Tag適用于組蛋白PTMs分析

2．CUT&Tag實驗條件通常需要比CUT&RUN更多的摸索及優化

3．CUT&Tag每次反應需要1,000至100,000個細胞

References

1. Preissl S et al. Characterizing cis-regulatory elements using single-cell epigenomics. Nat Rev Genet (2022). PubMed PMID: 35840754.

2. Mehrmohamadi M et al. A Comparative Overview of Epigenomic Profiling Methods. Front Cell Dev Biol 9, 714687 (2021). PubMed PMID: 34368164.

3. Carter B et al. The epigenetic basis of cellular heterogeneity. Nat Rev Genet 22, 235-50 (2021 PubMed PMID: 33244170.

4. Agbleke AA et al. Advances in Chromatin and Chromosome Research: Perspectives from Multiple Fields. Mol Cell 79, 881-901 (2020). PubMed PMID: 32768408.

5. Kaya-Okur HS et al. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc 15, 3264-83 (2020). PubMed PMID: 32913232.

6. Kaya-Okur HS et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun 10, 1930 (2019). PubMed PMID: 31036827.

7. Skene PJ et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13, 1006-19 (2018). PubMed PMID: 29651053?.

8. Skene PJ et al. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife 6, (2017). PubMed PMID: 28079019?.

9. Shah RN et al. Examining the Roles of H3K4 Methylation States with Systematically Characterized Antibodies. Mol Cell 72, 162-77 e7 (2018). PubMed PMID: 30244833.

10. Liu T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol 1150, 81-95 (2014). PubMed PMID: 24743991.

11. Zang C et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics 25, 1952-8 (2009). PubMed PMID: 19505939.

12. Evans MK et al. Ybx1 fine-tunes PRC2 activities to control embryonic brain development. Nat Commun 11, 4060 (2020). PubMed PMID: 32792512.

13. Laczik M et al. Iterative Fragmentation Improves the Detection of ChIP-seq Peaks for Inactive Histone Marks. Bioinform Biol Insights 10, 209-24 (2016). PubMed PMID: 27812282.

14. Meers MP et al. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin 12, 42 (2019). PubMed PMID: 31300027.

15. Yu F et al. CUT&RUNTools 2.0: A pipeline for single-cell and bulk-level CUT&RUN and CUT&Tag data analysis. Bioinformatics (2021). PubMed PMID: 34244724.

16. Liu N et al. Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch. Cell 173, 430-42 e17 (2018). PubMed PMID: 29606353.

17. de Bock CE et al. HOXA9 Cooperates with Activated JAK/STAT Signaling to Drive Leukemia Development. Cancer Discov 8, 616-31 (2018). PubMed PMID: 29496663.

18. Janssens DH et al. Automated in situ chromatin profiling efficiently resolves cell types and gene regulatory programs. Epigenetics Chromatin 11, 74 (2018). PubMed PMID: 30577869.

19. Uyehara CM et al. Direct and widespread role for the nuclear receptor EcR in mediating the response to ecdysone in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 9893-902 (2019). PubMed PMID: 31019084.

20. Zhang XL et al. Reorganization of postmitotic neuronal chromatin accessibility for maturation of serotonergic identity. Elife 11, (2022). PubMed PMID: 35471146.

21. Wang J et al. EZH2 noncanonically binds cMyc and p300 through a cryptic transactivation domain to mediate gene activation and promote oncogenesis. Nat Cell Biol 24, 384-99 (2022). PubMed PMID: 35210568.

22. Hainer SJ et al. Profiling of Pluripotency Factors in Single Cells and Early Embryos. Cell 177, 1319-29 e11 (2019). PubMed PMID: 30955888.

23. Mathsyaraja H et al. Max deletion destabilizes MYC protein and abrogates Emicro-Myc lymphomagenesis. Genes Dev 33, 1252-64 (2019). PubMed PMID: 31395740.

24. Roth TL et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559, 405-9 (2018). PubMed PMID: 29995861.

25. Collins PL et al. DNA double-strand breaks induce H2Ax phosphorylation domains in a contact-dependent manner. Nat Commun 11, 3158 (2020). PubMed PMID: 32572033.

26. Yusufova N et al. Histone H1 loss drives lymphoma by disrupting 3D chromatin architecture. Nature 589, 299-305 (2021). PubMed PMID: 33299181.

27. Janssens DH et al. Automated CUT&Tag profiling of chromatin heterogeneity in mixed-lineage leukemia. Nat Genet 53, 1586-96 (2021). PubMed PMID: 34663924.

28. Henikoff S et al. Efficient chromatin accessibility mapping in situ by nucleosome-tethered tagmentation. Elife 9, (2020). PubMed PMID: 33191916.

29. Deng Y et al. Spatial-CUT&Tag: Spatially resolved chromatin modification profiling at the cellular level. Science 375, 681-6 (2022). PubMed PMID: 35143307.

30. Gopalan S et al. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Mol Cell 81, 4736-46 e5 (2021). PubMed PMID: 34637755.

31. Xiong H et al. Single-cell joint detection of chromatin occupancy and transcriptome enables higher-dimensional epigenomic reconstructions. Nat Methods 18, 652-60 (2021). PubMed PMID: 33958790?.

32. Zhu C et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nat Methods 18, 283-92 (2021). PubMed PMID: 33589836.

33. Janssens DH et al. CUT&Tag2for1: a modified method for simultaneous profiling of the accessible and silenced regulome in single cells. Genome Biol 23, 81 (2022). PubMed PMID: 35300717.

34. Wu SJ et al. Single-cell CUT&Tag analysis of chromatin modifications in differentiation and tumor progression. Nat Biotechnol (2021). PubMed PMID: 33846646.

35. Bartosovic M et al. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nat Biotechnol (2021). PubMed PMID: 33846645.

如需了解更多詳細信息或相關產品，請聯系EpiCypher中國授權代理商-欣博盛生物